Адрес этой статьи в интернете: www.biophys.ru/archive/congress2012/proc-p81-d.htm

ПОЛИМОДАЛЬНЫЙ ЭФФЕКТ AЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА НА СТРУКТУРУ ЛИПИДОВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Е.Л. Мальцева, В.В. Белов, Н.П. Пальмина

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики

им. Н.М. Эмануэля РАН, Россия, 199334 Москва, ул. Косыгина 4, Е-mail: emal@sky.chph.ras.ru.

Одним из самых поразительных открытий последнего двадцатилетия является обнаружение действия биологически активных веществ (БАВ) - гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов (АО) и других агентов в сверхмалых дозах (СМД, <10^-13-10^{-11 М) на живые
системы различной степени сложности (от ферментов и мембран до целостных
организмов и популяций [1-11]. Несмотря на лавинообразное увеличение количества
фактов разнообразного характера о действии БАВ в СМД, механизм этого явления до
конца не установлен. Тем не менее, анализ имеющихся данных позволил выделить
ряд общих особенностей, наблюдающихся при действии БАВ в СМД, которые оказались
инвариантными по отношению как к природе самого вещества и особенностям его
метаболизма, так и к характеристикам его специфической мишени. Среди них можно
выделить следующие: немонотонная, нелинейная полимодальная зависимость
“доза-эффект”, изменение чувствительности биообъекта к действию разнообразных
агентов, как эндогенных, так и экзогенных, проявление различных кинетических
парадоксов, зависимость “знака” эффекта от начальных характеристик объекта,
“расслоение” свойств БАВ по мере уменьшения его концентрации, при котором еще
сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты [1].}

Природа таких общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишеней, одними из которых могут быть биологические мембраны. Именно в них локализованы важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки и организма: пероксидного окисления липидов (ПОЛ) во всех клеточных мембранах, а также системы вторичных посредников в плазматических мембранах клеток [12-15]. Существенную роль в регуляции ПОЛ играют природные антиоксиданты, среди которых одним из наиболее эффективных является α-токоферол (α-ТФ) [16]. α-ТФ принадлежит к группе витамина Е и является его наиболее физиологически активной формой [17], недостаток которой в организме приводит к тяжелым биохимическим нарушениям [18]. Благодаря своей липофильности и строению, a-ТФ сосредоточен в липидном бислое мембраны и поэтому способен непосредственно влиять на ее структурные и динамические свойства [19,20], в частности, образуя домены с определенной стехиометрией и фосфолипидным составом [21], а также связываясь с продуктами гидролиза липидов, оказывающих детергентно-подобное действие на мембрану [22].

Действие α-ТФ как на химических, так и биологических моделях исследовалось ранее в интервале относительно высоких концентраций 10^-6-10^-3М. Однако за последние двадцатилетие появились биохимические исследования, в которых достоверно установлено влияние α-ТФ на ПОЛ [23] и на активность одного из ключевых ферментов фосфоинозитидного цикла, являющегося одновременно пероксилипид-зависимым, протеинкиназы С (ПКС), в широком диапазоне концентраций (10^-2 -10^{-18 М) [24, 25].}

Известно, что функциональное состояние биологических мембран зависит от их текучести, которая меняется в зависимости от глубины погружения в липидный бислой. Следовательно, характер воздействия БАВ на вязкостные характеристики мембраны может отличаться в различных по глубине областях липидного бислоя. Кроме того, биологические мембраны являются важным объектом исследования действия БАВ в СМД, поскольку предполагается, что они при этом могут выступать в роли критических мишеней.

Поэтому представляло интерес изучить in vitro влияние различных концентраций α-ТФ, в том числе и сверхмалых, на вязкостные характеристики различных областей липидов эндоплазматичеких (ЭР) и плазматических мембран (ПМ), имеющих биохимические и функциональные отличия. Мембраны ЭР являются распространенным объектом изучения процессов ПОЛ и антиокислительных свойств БАВ, а в ПМ находятся во взаимодействии различные регуляторные системы, такие как ПОЛ и вторичных посредников, в частности, циклические нуклеотиды и фосфоинозитидный цикл.

В качестве объектов изучения были взяты мембраны ЭР и ПМ, которые выделялись из клеток печени мышей линии F₁(C₅₇xDBA₂) методом последовательного центрифугирования [26, 27]. Содержание белка в мембранах определяли по методу Лоури [28]. В результате содержание белка в мембранах ЭР составило 4 мг/мл, а в ПМ – 2,5 мг/мл. Спирто-водные растворы α-ТФ были получены методом последовательного разведения в кварцевой посуде через один порядок по концентрации исходного 10^{-1 М раствора α-ТФ спиртом высокой очистки
фирмы “}Merck” (Германия) до концентрации 10^{-3 М, а затем дистиллированной водой.}

Структурное динамическое состояние мембран ЭР и ПМ изучалось на ЭПР-спектрометрах “Bruker 200D” и “Bruker EMX” (Германия) методом спинового зонда [29, 30]. В качестве зондов были взяты стабильные нитроксильные радикалы 5- и 16-доксилстеариновые кислоты (зонды С₅ и С₁₆), локализующиеся на различных глубинах в липидном бислое (~ 8 и ~ 20 Å, соответственно) (рис.1). Конечная концентрация зондов в мембранах не превышала 6*10^-5М. Спектральные характеристики зондов С₅ и С₁₆ (параметр упорядоченности S, и время вращательной корреляции τ_с) использовали в качестве показателей жесткости поверхностных и микровязкости глубоколежащих областей мембраны при заданной температуре. Термостатирование образцов в резонаторе спектрометра ЭПР осуществляли с помощью термоприставки Bruker ER 4131 VT с точностью ±0,05 ˚С. Измерение параметров спектров ЭПР, входящих в формулы для S и t_с (рис. 1), осуществляли в автоматическом режиме с помощью оригинальных программ в вычислительной среде Origin 6.1 с использованием стандартных алгоритмов поиска экстремумов при заданном шаге дискретизации 0,06 Гс. Так, погрешность измерения расстояния между внутренним и внешними экстремумами в хорошо разрешенном спектре ЭПР зонда С₅ составляла 0,2 Гс, а суммарная ошибка вычисления отдельных значений t_с и S по экспериментальным спектрам ЭПР зондов С₁₆ и С₅, полученным в результате 3-х накоплений, не превышала 0,04 нс и 0,002, соответственно.

Расчет параметров полученных ЭПР - времени вращательной корреляции (τ_с) зонда С₁₆и параметра упорядоченности (S) зонда С₅ производился по стандартным формулам для быстровращающихся радикалов [29, 30].

*5-доксилстеариновая кислота (зонд С₅)*	*16-доксилстеариновая кислот (зонд С₁₆)*



Рис. 1. Спектры ЭПР спиновых зондов С₅ и С₁₆ в мембранах, иллюстрирующие формулы расчета параметра упорядоченности - S и времени вращательной корреляции - τ_c.

Схема, иллюстрирующая работу с образцами мембран, приведена на рис. 2, а на рис. 3 в качестве иллюстрации изображены типичные графики, описывающие изменение во времени параметров S и t_с. Средние контрольные значения t_с в мембранах ЭР и ПМ составляли (1,50±0,03)нс и (1,71±0,03) нс, соответственно, и находились в диапазоне быстрых вращений радикала С₁₆ [29]. Среднее контрольное значение S в мембранах ЭР равнялось 0,61±0,01, а в ПМ – 0,64±0,01. По порядку величины S, и t_с совпадали с немногочисленными данными других авторов [31 - 35]. Для каждой концентрации a-ТФ было произведено от 3 до 5 параллельных измерений на мембранах, выделенных независимо друг от друга в различные времена года, а эффект выражался в процентах по отношению к контролю.

Статистическая обработка данных осуществлялась методами параметрической и непараметрической статистики с использованием пакетов компьютерных программ Microsoft® Office Excel и Origin® 6.1 при статистической надежности 95%. Основной вклад в ошибку определения средних величин S и t_с вносила случайная составляющая, определяемая, прежде всего, статистическим характером изучаемых величин:

где (j - вычисляемый по экспериментальным данным параметр t_с или S).

В результате относительная случайная ошибка определения среднего значения не превышала для t_с 1%, а для S – 0,15%.

Рис. 2. Схема экспериментов с мембранами

В работе были изучены также температурные зависимости структурно-динамических параметров липидов мембран (S и τ_c) c точностью ±0,05⁰K . Регистрацию спектров ЭПР проводили в диапазоне температур от 285 до 320⁰К, с точностью термостатирования ±0,05⁰K..

В качестве характеристики изменений, происходящих в мембране при изменении (увеличении температуры термостарирования), использовалось представление о термоиндуцированных структурных перестройках («переходах») в липидах [36], которые отображаются точками излома между линеаризованными участками температурных зависимостей τ_с зонда С₁₆ и S зонда С₅, представленных в Аррениусовых координатах –Lgτ_c или –LgS от 1/Т (рис.4). Точками излома считали те точки, добавление которых к спрямленному участку графика выводило коэффициент корреляции за пределы норм, определяемых числом степеней свободы и статистической надежностью 95%. Эффективная энергия активации перехода вычислялась по формуле, приведенной ниже, на основе тангенса угла наклона спрямленного участка температурной зависимости в Аррениусовых координатах [36, 37].



	tgα=-b, =2,3bR, где R = 8,31 Дж·моль^-1К^-1
Рис. 3. Типичные графики, описывающие изменение во времени параметров S (для 10^{-16 М} α-ТФ) и t_с (для 10^{-7 М) в ПМ.}	Рис. 4. Характерная температурная зависимость τ_с зонда С₁₆ в Аррениусовых координатах на примере контрольной пробы.

Рис. 5. Эффект a-ТФ в зависимости от концентрации на микровязкость глубоколежащих (τ_с, а) и жесткость поверхностных (S, б) областей липидного бислоя мембран при температуре 293⁰ К.

Нами установлено, что зависимости эффектов α-ТФ от его концентраций в широком диапазоне (10^-4–10^{-25 М) на микровязкость глубоколежащих (рис.5а) и жесткость
поверхностных (рис.5б) областей мембран ЭР и ПМ при температуре 2930}К имеют в значительной степени аналогичный нелинейный, полимодальный характер, типичный для действия БАВ в широком диапазоне концентраций, включающем СМД. Полимодальность дозовых зависимостей связана с наличием достоверных изменений в трех областях концентраций: области «физиологических» концентраций α-ТФ (10^-4–10^{-9 М), в которых он
обычно действует в организме, СМД (10-9}–10^{-18 М) и даже ультранизких
разведений (10-18}–10^{-25 М),
при которых вероятность нахождения хотя бы одной молекулы α-ТФ в
мембранной суспензии близка к нулю. Необходимо отметить при этом, что значения
эффектов в каждой из приведенных областей вполне сравнимы между собой по
величине. Максимумы и минимумы разделены так называемыми «молчащими» или
«мертвыми» зонами, где эффект α-ТФ на исследуемые структурно-динамические
характеристики мембран отсутствовал. Таким образом, α-ТФ по характеру
своего воздействия на мембраны может быть отнесен к типу БАВ, проявляющих
эффект как в сверхмалых концентрациях (< 10-11}-10^{-13 М), так и
ульранизких разведениях (<10-18 M}).



Рис. 6. Температурные зависимости τ_с зонда C₁₆ в диапазоне 285–320⁰ К в контроле и при действии различных концентраций a-ТФ in *vitro* в мембранах ЭР.

Рис. 7. Температурные зависимости параметра S зонда С₅ в диапазоне 285–319⁰ К в контроле и при действии различных концентраций a-ТФ in *vitro* в мембранах ЭР.

Рис. 8. Температурные зависимости τ_с зонда С₁₆ в диапазоне 285–319⁰К в контроле и при действии различных концентраций a-ТФ in *vitro* в ПМ.

Рис. 9. Температурные зависимости параметра S зонда С₅ в диапазоне 285–319⁰ К в контроле и при действии различных концентраций a-ТФ in *vitro* в ПМ.

Биологические мембранные структуры являются гетерогенными системами, характеризующимися наличием субмезофаз, поэтому помимо изменений вязкостных характеристик мембраны при постоянной температуре очень важными параметрами, описывающими происходящие изменения в структуре ее липидного бислоя, являются количество и качество термоиндуцированных структурных переходов в нем, а также эффективная энергия их активации в глубоколежащих областях липидов. Для концентраций α-ТФ, соответствующих экстремумам и «мертвым зонам» на дозовых зависимостях на рис. 5, в обоих типах мембран были изучены температурные зависимости параметра упорядоченности S (характеристики жесткости поверхностных областей липидов) и времени вращательной корреляции τ_с (характеристики микровязкости глубоколежащих областей липидов) в диапазоне 285-319⁰ К. Для выявления термоиндуцированных структурных переходов липидов (табл. 1 и 2) и определения эффективной энергии их активации полученные кривые были представлены в Аррениусовых координатах –Lgτ_c или –LgS от 1/Т (рис. 6-9).

Как видно из данных табл. 1-2, те концентрации α-ТФ, которые соответствуют максимумам и минимумам на дозовых кривых на рис. 5, в обоих типах мембран вызывают

б

а

появление дополнительных по сравнению с контролем термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое, что может быть связано, по нашему мнению, с образованием микродоменных структур в мембране. Важно отметить, что большинство таких дополнительных перестроек в липидном бислое (в табл. 1 и 2 – заштрихованы) обнаруживается в области физиологических температур 307-314⁰ К (34-41°С). Учитывая большое значение фазовых переходов в липидах биологических мембран в жизнедеятельности клетки (изменения проницаемости мембраны, образовании пор, слиянии мембран, терморегуляции и т.д.) [38, 39], этот факт может иметь важное регуляторное значение при действии не только «физиологических», но и сверхнизких и даже ультранизких разведений α-ТФ. В частности, для ключевого фермента фосфоинозитидного цикла - ПКС, активность которого, как показaно на исскуственных мембранах, зависит от фазового состояния липидного бислоя [40].

Представленный экспериментальный материал позволяет заключить, что для обоих типов используемых мембран обнаруживаются одинаковые особенности действия различных концентраций α-ТФ на структуру их липидного бислоя, ключом для понимания которых могут являться общие механизмы наблюдаемых эффектов. При этом в зависимости от концентрации α-ТФ преобладающий вклад могут давать различные процессы, чем и обусловлен, по-видимому, полимодальный характер зависимостей доза-эффект (рис. 5), одинаковый для мембран ЭР и ПМ.

Табл. 1. Положения термоиндуцированных структурных переходов в поверхностных областях (~8А0) липидного бислоя мембран ЭР (а) и ПМ (б) в контроле и при действии различных концентраций a-ТФ. .

Табл. 1. Положения термоиндуцированных структурных переходов и эффективная энергия активации (_,кДж/моль) в глубоколежащих областях (~20Å) липидного бислоя мембран ЭР (вверху) и ПМ (внизу) в контроле и при действии различных концентраций a-ТФ

Упорядочивание поверхностных и повышение микровязкости в глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран при введении в них a-ТФ в «физиологических» концентрациях (10^-4–10^{-9 М) обусловлено,
прежде всего, ограничениями при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи
молекулы}a-ТФ, что снижает их конформационную подвижность. Во многом эти процессы могут быть связаны с взаимодействием α-ТФ с молекулами фосфолипидов, приводящим к образованию комплексов с определенной стехиометрией [41]. Их распределение в плоскости мембраны может иметь произвольный характер, а также они могут образовывать домены и вызывать фазовое разделение, что проявляется в виде дополнительных термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран печени (табл. 1 и 2). Увеличение вязкости или снижение текучести мембраны при встраивании в нее a-ТФ в «физиологических» концентрациях было не раз показано различными физическими методами в опытах на биологических и модельных мембранах, в том числе и методом спиновых зондов ЭПР [20], и наши данные согласуются с их результатами.

Одним из возможных объяснений эффектов СМД α-ТФ (10^-9–10^{-18 М) на
вязкостные свойства поверхностных и глубоколежащих областей микросомальных и
плазматических мембран может являться его специфичное, высокоэффективное
взаимодействие со связывающими центрами на мембране, изменяющее их
конформационное состояние. В качестве такого связывающего центра в данном
случае мы предполагаем поверхностный мембранно-связанный фермент ПКС, поскольку
ранее в работах [24, 25] было показано ингибирование его активности α-ТФ
носит бимодальный характер с эффектами при СМД. В пользу высказанного
предположения говорит и высокая степень корреляции, полученная при
сопоставлении этих данных с изменением жесткости поверхностных областей, как
микросомальных (ρ<0,0001,}r=0,95, рис. 10,а), так и плазматических (ρ=0,0047, r=0,87, рис. 10,б) мембран. В этой связи стоит отметить, что содержание активной формы ПКС в микросомальных мембранах печени значительно ниже, чем в плазматических, при этом и эффект α-ТФ в СМД на жесткость поверхностных областей мембран ЭР в 3 раза меньше, чем в ПМ (рис. 5Б). В частности, в работах других авторов было показано, что вещества, стабилизирующие липидный бислой или повышающие жесткость липидов, являются ингибиторами ПКС [42, 43]. Влияние α-ТФ на активность данного фермента и структурное состояние липидов клеточных мембран является именно таким.


Рис. 10. Изменение жесткости поверхностных областей мембран ЭР (а) и ПМ (б) и ингибирование активности ПКС в зависимости от концентрации α-ТФ: А – микросомальных ( р<0,0001, r=0,95) и Б – в плазматических (p<0,0047, r = 0,87)

Другим вероятным объяснением упорядочивания липидного бислоя мембран ЭР и ПМ при действии α-ТФ в СМД, по нашему мнению, может являться инициирование им образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране или модификация уже имеющихся. В ПМ в их роли могут выступать рафты, которые представляют собой особые области в мембране, значительно более упорядоченные по сравнению со своим микроокружением. Высказанное предположение основывается на том, что многие белки, участвующие в передаче сигналов в клетке, способны локализоваться в рафтах, в том числе и ПКС [44]. Время жизни таких комплексов невелико (меньше 1 мс), однако действие внешних сигналов (в роли которых могут выступать лиганды), вызывающих конформационные изменения в белковых молекулах, может его значительно увеличить (вплоть до нескольких минут) и, кроме того, привести к объединению отдельных рафтов в более крупный домен. Поэтому мы предполагаем, что подобные процессы сопровождают взаимодействие α-ТФ в СМД с ПКС в процессе ингибирования ее активности.

Присутствие α-ТФ в мембране, как в «физиологических», так и в сверхнизких концентрациях может влиять и на сам процесс формирования рафтов. Так, в качестве одного из механизмов их образования в литературе рассматривается пространственная несовместимость в жидко-кристаллической фазе между твердой стерольной структурой молекулы холестерина и жестким изгибом ненасыщенной углеводородной цепи соседней молекулы фософлипида, имеющей цис-двойную связь в положении С9-С10 [44]. Такая затрудненность во взаимной упаковке молекул приводит к выталкиванию холестерина из областей с ненасыщенными фосфлипидами, с последующей его концентрацией и стабилизацией в областях с преимущественно насыщенным характером жирнокислотных цепей фосфолипидов. В этой связи стоит отметить, что α-ТФ, в свою очередь, с большим предпочтением взаимодействует с полиненасыщенными фосфолипидами, способствуя, таким образом, вытеснению холестерина и облегчая образование рафтов при действии α-ТФ как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД.

Предложенные механизмы с участием рафтов могут быть рассмотрены с определенной долей вероятности и в микросомах печени, если принять во внимание, что некоторых работах высказываются обоснованные предположения об их существовании в микросомальных мембранах [45, 46].

Для понимания механизмов действия БАВ, и α-ТФ в частности, в СМД принципиальное значение имеют работы, выполненные под руководством акад. Коновалова по обнаружению ранее неизвестного явления – самопроизвольного образования в высокоразбавленных водных растворах химических веществ (10^-20-10^{-6 М) наноразмерных заряженных ассоциатов в
[47-50]. Параметры наноассоциатов: эффективный гидро-динамический диаметр
кинетически подвижной частицы в максимуме кривой распределения (}D) от 100 до 300 нм и ζ-потенциал от -2 до 20 мВ, а также физико-химические свойства растворов: удельная электропроводность (χ, мкСм/см, Т =298⁰K) и диэлектрическая проницаемость, нелинейно изменяются в зависимости от концентрации растворов. При этом в работах [47-50] было показано, что водные растворы α-ТФ имели мономодальное распределение частиц по размерам в интервале концентраций 10^-3 - 10^{-20 М (данные на этом интервале использовались для
построения концентрационных зависимостей и последующего анализа
экспериментальных данных), и полимодальное в диапазоне 10-21} -10^{-25 М. Проведенное
нами совместное исследование по сравнительному анализу изменения структурных
параметров липидов мембран под действием α-ТФ и вышеперечисленных
характеристик наноассоциатов и его водных растворов выявило аналогию в их
изменении, особенно в интервале концентраций (10-20} - 10^{-12 М) [51].
Получена корреляция между параметром упорядоченности (S) поверхностных областей
липидов мембран, диаметром наноассоциатов (}D) и удельной электропроводностью (χ), результаты представлены на рис. 11. Для этого интервала концентраций растворов α-ТФ ранее нами были обнаружены изменения в ИК-спектрах, свидетельствующие об изменении состояния водной среды [52]. Учитывая значительные размеры наноассотатов и низкие концентрации веществ, в данном случае α-ТФ, логично предположить, что в образовании таких ассоциатов принимают участие не только гидратированные молекулы БАВ, но и структуры воды. Возможный механизм действия СМД α-ТФ на биологические мембраны мембраны in vitro связан с формированием супрамолекулярных наноассоциатов антиоксиданта, содержащих структуру воды с особыми свойствами, перестройка которых в определенных интервалах концентраций приводит к образованию «активных» наноассоциатов с экстремальными значениями размера и ζ-потенциала, а также изменению физико-химических свойств водных растворов α-ТФ.

Совокупность полученных данных позволяет сделать выводы о том, что:

1. Полимодальный эффект альфа-токоферола (α-ТФ) в широком диапазоне концентраций (10^-4-10^{-20 М) на
структурно-динамические характеристики липидов, определенные методом ЭПР,
является типичным для действия веществ в СМД.}

2. При действии α-ТФ в диапазоне концентраций 10^-5 – 10^{-17 М} на мембраны увеличение жесткости поверхностных областей липидов взаимосвязано с ингибированием активности протеинкиназы С .

3. Возможный механизм действия α-ТФ в диапазоне 10^{- 3} - 10^{-20 М
связан с изменениями параметров образующихся наноассоциатов и физико-химических
свойств его растворов.}



Рис. 11. Сопоставление изменений параметра упорядоченности (S) поверхностных областей липидов плазматических мембран и средним диаметром наноассоциатов ( вверху), удельной электропроводностью растворов б-ТФ (внизу).

РOLYMODAL DOSE-EFFECT OF ALFA-TOCOPHEROL ON LIPID STRUCTURE OF CELL MEMBRANES

E.L. Maltseva, V.V. Belov, N.P. Palmina

N..M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of Russian Academy of Sciences, emal@sky.chph.ras.ru.

Литература

1. Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал, 1999, т.18б № 5, с.3.

2. Духович Ф.С., Горбатова Е.Н., Курочкин В.К.., Петрунин В.А. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.12.

3. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова Т.А. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.21.

4. Зайцев С.В., Ефанов А.М., Сазанов Л.А. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.28.

5. Ямсков И.А., Ямская В.П., Даниленко А.Н., Клеменкова З.С., Антипов Б.Г., Черников Ф.Р., Гусыгина М.М., Рыбакова Е.Ю. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.34.

6. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Пынзарь Е.Н., Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.55.

7. Полезина А.С., Аникиенко К.А. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.72.

8. Молочкина Е.М., Озерова И.Б., Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.63.

9. Воронина Т.А., Молодавкин Г.М. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.96.

10. Новожилова Т.И., Малекин С.И., Курочкин В.К.. Бугхлала С., Киселевский М.В. // Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.89.

11. Бонавида Б. Иммунологические эффекты веществ в сверхмалых дозах: новые механизмы и синергетические взаимодействия // Российский химический журнал, 1999, т.18. № 5, с.100.

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. // Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М, Наука, 1972.

13. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. // Успехи химии, 1985, т.54, с.1540.

14. Nishizuka Y. // Sciences, 1984, v. 225, p.1365.

15. Ткачук В. А. // Введение в молекулярную эндокринологию/ М., 1983.

16. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. // Биологические мембраны. 1998, т.15, с.137.

17. Machlin L.J. // Vitamin E. New York, Marcel Dekker, 1980.

18. Keaney J.F.,Simon D.I., Freedman J.E. // FASEB JOUNAL, 1999, v.13, p.965.

19. Quinn P.J. // Biochemistry, 2004, v.69, p.58.

20. Wassall S.R.,McCabeR.C., Ehringer W.D., Stilwell W. // Chemistry and Physics of Lipids, 1991, v.60, p.29.

21. Quinn P.J. // Eur. J. Biochemistry, 1995, v.233, p. 916.

22. Kagan V.E. // Annal NY. Acad.Sci., 1969, v.570, p.121.

23. Пальмина Н.П., Кледова Л.В., Панкова Т.В., Мальцева Е.Л., Белов В.В., Жерновков В.Е. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2004, т .4, с.31.

24. Пальмина Н.П.. Мальцева Е.Л., Бурлакова Е.Б.// Химическая физика, 1995, т.14, № 11, с.47.

25. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. // Биологические мембраны, 1998. т. 15, № 2, с.199.

26. Hostetler K.Y., Zenner D.B., Morris H.P. // Biochemical Biophysical Acta, 1976, v.441, p.231.

27. Loten E.G., Redshaw-Loten J.C. // Analitical Вiochemistry, 1986, v.154, p.183.

28. Lowry O., Rosenbrouch N., Barr A., Randall R. // Journal of Biological Chemistry, 1951, v.193, p. 265.

29. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М. Из-во Наука, 1976.

30. Метод спиновых меток (п/ред. Л.Берлинера). М. Из-во Мир. 1979.

31. Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы) (п/ред. Жданова Р.И.). М. Наука, 1986.

32. Whetton A.D., Houslay M.D., Dodd N.J.F., Evans W.H. // Biochemical Journal, 1983, v.214, № 3, р. 851.

33. Curtis MT, Gilfor D, Farber JL. //Arch. Biochem. Biophys. 1984, v. 235, № 2, р.644.

34. Parshina E.Yu.; Gendel L Ya.; Rubin A. B. // Biology Bulletin, 2007, v. 34, № 6, р. 537.

35. Мальцева Е.Л. Спиновые зонды в изучении биологических мембран. // Применение электронного парамегнитного состояния для исследования биологических систем (п/ред. Коварского А.Л.). М. МАКС Пресс, 2005, с.102.

36. Chapman D. // Quart. Rev. Вiophys., 1975, v.8, p.185.

37. Shinitzky M, Inbar M. // Biochem.Biophys. Acta, 1976, v.433, p.133.

38. Антонов В.Ф., Смирнова, Е.Ю., Шевченко Е.В. // Липидные мембраны при фазовых превращениях. М., Наука, 1999, гл. 4.

39. Харакоз Д.П. // Успехи Биологической химии, 2001, т.41, с.333.

40. Micol V., Sánchez-Piñera P., Villalaín J., de Godos A., Gómez-Fernández J.C. //Biophysical .Journal, 1999, v.76, № 2, р. 916.

41. Gomez-Fernandes J.C., Villalain j., Aranda F.J. at al. // Annal New Your Acad.Sci., 1989, v.570, c. 109.

42. Epand RM, Stevenson C, Bruins R, Schram V, Glaser M. // Biochemistry, 1998, v. 37, № 3, р.12068.

43. Giorgione J.R, Huang Z., Epand R.M. //

44. Biochemistry, 1998, v. 37, № 8, р. 2384.

45. Pike L.J. // Journal of Lipid Research, 2003, v .44, p 65.

46. Subczynski V.K., Kusumi A. // Biochemical Biophysical Acta., 2003, v. 1610, p. 231.

47. Mayor S., Sabharanjak s.,Маxfield F. // EMBO J., 1998, v. 17, p. 4626.

48. Muniz M., Mosomme P., Riezman H. // Cell, 2001, v.104, p. 313

49. .Коновалов А.И., Рыжкина И.С., Муртазина Л.И, Тимошева А.П., Шагидуллин Р.Р., Чернова А.В., Аввакумова Л.В., Фаттахов С.Г. // Известия АН, сер. хим., 2008, № 6, с.1207.

50. Рыжкина И.С., Муртазина Л.И., Киселева Ю.В., акад. Коновалов А.И. // Доклады АН, 2009, т.428, № 4, с. 487.

51. Рыжкина И.С., Муртазина Л.И., Киселева Ю.В., акад. Коновалов А.И. // Доклады АН, 2009, т.428, № 5, с. 628.

52. И.С. Рыжкина, Ю.В. Киселева. Л.И. Муртазина, Н.П. Пальмина, В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Е.Д. Шерман, А.П. Тимошева, акад. А.И. Коновалов. //Доклады АН, 2011, т.438, №5, с.63.

53. Белов В.В., Рощина И.А., Шматов Г.П., Зубарева Г.М., Пальмина Н.П. // Доклады АН, 2011, т.439, № 1, с.1.